Das Nonnenstift Traunkirchen gehörte zu jenen mittelalterlichen Frauenklöstern, die man treffend als "Hospitäler des Adels" bezeichnet hat. Ledig gebliebene Töchter der angesehensten Familien des Landes fanden hier die Möglichkeit eines sinnerfüllten (religiösen) Lebens, aber auch eine dem adeligen Lebensstandard entsprechende Versorgung; Urkunden des 14. Jahrhunderts zeigen, dass ein großer Teil der Klostereinkünfte an die Nonnen verteilt wurde.
Die Leitung des Klosters hatten hochadelige Äbtissinnen inne, als Vertreterinnen des Konvents standen ihnen Dechantinnen zur Seite. Nach dem Seckauer Verbrüderungsbuch - Traunkirchen war mit anderen Klöstern durch Konföderationen verbunden - lebten um 1180 neben der Äbtissin 22 Nonnen im Kloster, seit dem 13. Jahrhundert scheint wiederholt die Zwölfzahl; noch 1495 gaben bei der Äbtissinnenwahl zwölf Nonnen ihre Stimme ab. Das Kloster war nicht nur eine Stätte besonderer Frömmigkeit, sondern auch ein Zentrum von Kunst, Musik und Bildung (Klosterbibliothek, Klosterschule vor 1490). Der Äbtissin stand das - freilich wiederholt umstrittene - Recht zu, den Pfarrer zu ernennen; die Pfarre umfasste neben der Klostersiedlung auch das erst spät besiedelte Land um Ebensee. Höhepunkte des kirchlichen Lebens waren vor allem die Weihefeste und Patrozinien (Feste der Kirchenpatrone) der drei Kirchen, die von einer großen Zahl von Gläubigen besucht wurden, am Stiftertag der Klosterkirche sollen es nach Aussage der Quellen Tausende gewesen sein, sie wurden auch bewirtet.
Der Niedergang des Klosters und des kirchlichen Lebens in Traunkirchen setzte ab 1534 infolge der sich ausbreitenden Reformation ein. Seit 1512 studierten junge Leute aus den Pfarren des Klosters in Wittenberg, sie brachten bei ihrer Rückkehr lutherisches Gedankengut mit. Das Ordensleben verlor seine alte Wertschätzung, was zu einem deutlichen Rückgang des Konvents führte: Die Zahl der Nonnen sank von zehn im Jahr 1534 auf sieben (1543), fünf (1551) und schließlich 1565 auf zwei. Die landesfürstlichen Visitationen von 1561 und 1566 zeigten, dass die klösterliche Gemeinschaft - und auch der Pfarrer - in wesentlichen Punkten protestantisch dachten. In der Klosterschule wurde Luthers Katechismus unterrichtet, Pfarrer und Kaplan waren "beweibt", die Nonnen empfingen die Kommunion unter beiden Gestalten, die letzten Äbtissinnen scheinen am Klosterleben kaum noch Interesse gehabt haben.
Als 1571 die letzte Nonne das Kloster verließ, um zu heiraten, wurde die Äbtissin abgesetzt und das Stift für etwa 50 Jahre von verschiedenen Administratoren verwaltet. Diese begannen schon 1573 mit der Rekatholisierung und setzten in Traunkirchen wieder einen katholischen Pfarrer ein. Laufend bestanden Pläne, im Kloster neue Orden anzusiedeln; die beginnende Gegenreformation führte schließlich dazu, dass das Stift 1622 den Jesuiten übergeben wurde, die von hier aus gegenreformatorische Maßnahmen in den zum Kloster gehörenden Pfarren einleiten sollten.